7、基因突变株与初始菌种的生长发育特性及产胰蛋白酶系魅力对比实验

（1）菌体形状对比实验

取活性好的基因突变株和初始菌种试管婴儿斜坡，各自用木签点种于PDA细胞培养皿核心，30℃静放塑造，每过24h观查菌体形状转变，在无菌车间净化工作台照相纪录。

（2）外部经济形状对比实验

选用盖玻片塑造观察，在塑造期内每过12h取下基因突变株与初始菌种盖玻片，放置显微镜下观查并对二者的外部经济形状开展较为。

（3）产胞子工作能力对比实验

胞子成分测量参考种曲胞子数测定方法。

取活性好的基因突变株和初始菌种的胞子混液（107CFU／mL）按1.0％注射于种曲培养液中搅拌均匀，在32℃的恒温箱中沉积塑造。塑造至15h后，将曲料打撒开展第一次摇瓶，并减温至30℃铺平塑造。大概22h后，将曲料打撒后然后铺平塑造，期内在第三6、48、60、72和84h开展抽样，测量二者胞子成分。

（4）胰蛋白酶系魅力对比实验

将K值比较大的18株初筛菌种活性，制取胞子悬浮液并稀释液至10⁷CFU／mL。依据曲霉型水豆豉浅盘酒曲制作加工工艺，依照1.0％的接种量，早期发酵温度操纵在30～34℃，酒曲制作至第一8～24h，黄豆粒表层满布乳白色真菌，开展第一次翻曲；当曲醅发生品绿胞子时，开展第二次翻曲，温控在28～32℃。塑造至72h抽样，选用SB/T10317—1999中的福林酚测定方法各菌种曲醅中性蛋白酶魅力fl基因突变株和初始菌种酒曲制作期内，在第24、36、48、60、72和84h开展抽样，胰蛋白酶魅力（中性化、偏碱及酸碱性胰蛋白酶）测量选用SB/T10317一1999中的福林酚法。

8、数据分析

本科学研究试验数据信息用EXCEL手机软件开展基本上解决，并且用SPSS20.0手机软件的0ne—WayANOVA对其显著性差异开展剖析；用Origin9.0手机软件开展制图。

二、結果与剖析

1、米曲霉死亡率曲线图制作

由图1得知，伴随着ARTP诱变時间的增加，其所造成的伤害功效可使菌体死亡率持续上升，在0～1min菌体死亡率升高显著，2～7min增长幅度持续减少，7min之后死亡率贴近100％，本试验至死曲线图的总体行情与ZhangN、司晓光报导的“马鞍子型”存活曲线十分符合。当解决的时间为3min时，“马鞍子型”至死曲线图发生转折点的因素可能是诱变時间的提高造成 ARTP对DNA的伤害功效提升，促进菌体运行SOS修补体制，其诱发造成DNA聚合酶IV和V对DNA链损害位置的碱基失衡不具有校准作用，SOS不精准修补开启菌体微生物反映体细胞中繁杂的管控互联网，导致遗传信息及新陈代谢路径的更改，为此来解决ARTP损害刺激性，菌体死亡率降低。但当损害抗压强度超出菌体修补体系的極限时，菌体便会大批量身亡，因而7min之后菌体死亡率贴近100％。

2、初筛結果

点种取决于调查优质菌种是不是能在集中的培育中仍能保持较高的中性蛋白酶魅力，而且规定菌种的发育速度快，对自然环境适应能力强。菌种正基因突变主要表现为菌体涨势好而且K值比对比值大。由表1得知，18株初筛菌种的K值均超过初始菌种，其产中性蛋白酶工作能力很有可能好于初始菌种，在其中菌种NCU—A38、NCU—A55、NCU—A17菌体涨势不错，且全透明圈直徑较大，各自为25.6、23.5、23.5mm，而他们的K值则各自实现了2.08、2.04、1.77。袁艳玲研究表明，根据K值挑选正基因突变株高效率，但菌种的产中性蛋白酶工作能力与K值并并不是呈规律性的线性相关。因此必须进一步的复筛来明确最后增产中性蛋白酶活的基因突变株，试验选用浅盘酒曲制作测量中性蛋白酶活给予认证。

3、复筛結果

图中融合表1能够看得出，初始菌种和18株初筛菌种中性蛋白酶魅力尺寸与K值的关联：整体上，酶魅力随K值的增加而扩大，例如基因突变株NCU—A38、NCUA55、NCU—A17的K值比较大，而且其酶活也明显高过别的菌种（JP＜0.05）。在其中基因突变株NU—A38中性化胰蛋白酶魅力最大，为765.4U/g，提升 了25.0％，基因突变株NCU—A55、NCU—A17酶活也各自提升了21.0％、17.0％，成效显著。但有一些K值比较大的菌种例如NCU—A9、NCU—A21，中性蛋白酶魅力并不高。本试验結果与赵少华等选用紫外线诱变培育氨肽酶增产菌种的分析結果大致同样，有一些初筛K值比较大的菌种在经复筛后其酶促反应反倒不高，从而这也表明了复筛的重要性。依据复筛結果，选择NCU—A17、NCU—A38、NCU—A55三株中性蛋白酶魅力明显提升的基因突变株开展基因遗传可靠性认证试验，最后确认出特性优质的菌种。