甜叶菊（SteviarebaudianaBertoni）属多年生菊科草本植物，原产于南美洲和巴西的高山草甸，特别是南美巴拉圭东北部。甜叶菊中富含甜菊糖苷，被广泛用作天然甜味剂。有研究报道从甜菊提取物中鉴定出89种化合物，并将其分为多酚类化合物、萜类化合物、氨基酸衍生物、脂肪酸及其衍生物类、低聚糖、糖脂类、嘌呤和维甲酸等。这些化合物具有多种生物活性，如抗氧化，抑菌，抗肿瘤等。甜菊提取物中的多酚和黄酮类化合物具有很强的体外清除自由基的能力。然而，关于甜叶菊提取物体内抗氧化活性的研究鲜有报道。在生产甜菊糖苷的过程中会产生大量的絮凝废渣，其中含有大量的多酚类化合物，而这些副产物尚未得到充分利用。研究甜叶菊废渣提取物的抗氧化、抗衰老作用，对充分开发利用甜叶菊资源具有重要意义。

本研究采用高效液相色谱法（HPLC）对两种甜叶菊废渣提取物中的主要成分进行定量分析，并测定其对D-半乳糖致衰老小鼠血清、肝脏和脑组织中一些重要的抗氧化指标（如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和丙二醛（MDA），以及脑组织中Nrf2及其靶基因（SOD1，GPx1，HO-1）的mRNA表达水平的影响等，探讨甜叶菊废渣提取物对D-半乳糖致衰老小鼠的抗氧化作用，为其进一步开发和应用提供理论依据。

一、材料与方法

1、试验材料

两种甜叶菊废渣提取物，晨光生物科技集团股份有限公司。

2、实验动物

SPF级昆明种雄性小鼠（33～37g，SPF级，8周龄），军事医学科学院实验动物中心，动物合格证号：SCXK-（军）2012-0004。

3、主要试剂

D-半乳糖（分析纯级），国药集团化学试剂有限公司；茶多酚（茶多酚＞88%、EGCG＞40%、儿茶素=0.76%），成都华高生物制品有限公司；咖啡酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、槲皮素、槲皮苷（纯度均≧98%），成都瑞芬斯生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、丙二醛（MDA）测定试剂盒，南京建成生物工程研究所；BCA法蛋白定量试剂盒、高纯总RNA快速提取试剂盒（离心柱型），北京百泰克生物技术有限公司；FastQuantcDNA第一链合成试剂盒（去基因组），天根生化科技（北京）有限公司；甲醇（色谱级），北京迈瑞达科技有限公司；其它试剂均为国产分析纯级。

4、仪器与设备

Agilent1290超高效液相色谱，美国安捷伦科技有限公司；DY89Ⅱ匀浆机，宁波新芝生物科技有限公司；SpectraMax13连续波长多功能酶标仪，美国MolecularDevices公司；3K15台式离心机，德国Sigma公司；S1000PCR扩增仪、CFX96荧光定量PCR仪，美国伯乐公司；NanoDropTM2000微量紫外-可见光分光光度计，美国赛默飞世尔公司。

5、试验方法

（1）两种甜叶菊废渣提取物中主要成分的定量分析

本实验室研究人员前期研究证实，甜叶菊废渣提取物的主要成分为咖啡酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、槲皮素和槲皮苷。采用HPLC法对两种甜叶菊废渣提取物中的主要成分进行定量分析。高效液相色谱条件为：AgilentEclipsePlusC18色谱柱（50mm×2.1mm，1.8μm），流动相为0.1%甲酸（A）和甲醇（B），流速0.1mL/min。洗脱程序：0～10min，10%～50%（B）；10～12min，50%～10%（B）；12～15min，10%（B）。检测波长320nm和360nm，柱温30℃，进样量1μL。采用咖啡酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、槲皮素和槲皮苷为标准品，按上述色谱条件分别测定。以标准品的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制HPLC标准曲线，并测定两种甜叶菊废渣提取物中各主要成分的含量。

（2）甜叶菊废渣提取物对D-半乳糖致衰老小鼠的抗氧化作用

①小鼠饲养条件

小鼠饲养于北京市食品添加剂工程技术研究中心，室内通风条件良好，正常昼夜变化（9:00-21:00），相对湿度（40±5）%，室温（21±2）℃。

②实验分组及操作

80只实验小鼠适应7d，喂食普通饲料，自由饮水、觅食。适应期后，随机等分为正常组、D-半乳糖组、两种甜叶菊废渣提取物低、中、高剂量组（分别灌胃100，200，500mg/kgbw甜叶菊废渣提取物），每组10只，同时用苦味酸对小鼠进行编号。各组在灌胃的同时，D-半乳糖组和甜叶菊废渣提取物组，颈背部皮下注射5%的D-半乳糖溶液（500mg/kgbw），正常组注射等体积的生理盐水。每日给药1次，持续时间为11周。

③待测样本制备

实验结束后，小鼠禁食（不禁水）11h。11h后，小鼠摘眼球取血，全血收集于干净的1.5mL离心管中，37℃水浴15min，4000×g离心15min分离血清，-80℃保存待测。采血后，将小鼠断颈处死并解剖，取出肝脏和脑组织并将其在预冷的生理盐水中漂洗，去除血液，用滤纸吸干表面水分。将肝脏和脑组织一部分放入小离心管里，立即放入液氮（-196℃）中速冻，转入超低温冰箱（-80℃）存放，备用。另一部分剪碎，加入9倍0.9%预冷的生理盐水，置玻璃匀浆器中冰水浴迅速研磨制成组织匀浆，4℃，12000×g离心15min，取上清液，-80℃保存备用。

④血清及组织抗氧化指标的测定

测定血清、肝和脑组织匀浆中SOD，GPx活力及MDA含量，检测方法具体操作按试剂盒说明进行。

⑤荧光定量PCR检测小鼠脑mRNA表达水平

采用高纯总RNA快速提取试剂盒提取各组小鼠脑组织中总RNA，使用NanoDropTM2000微量紫外-可见光分光光度计检测其完整性及其浓度。按逆转录试剂盒操作说明，将提取的RNA逆转录成cDNA并置于-20℃保存。通过SYBRGreen法进行荧光定量，反应体系如下（20μL）：无RNA酶水7.4μL，SuperRealPreMixPlus（SYBRGreen）10μL，上下游引物各0.8μL，cDNA模板1μL。RT-PCR反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，40个循环。以β-actin为内参基因进行实时荧光定量PCR分析。计算方法采用比较CT值法。涉及的引物序列见表1。

(3）数据统计分析

采用SPSS20.0统计软件，试验数据以平均数±标准偏差（Mean±SD）表示，用单因素方差分析（one-wayANOVA）及多重比较（Duncan）进行差异显著性分析，P＜0.05为差异显著。

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