核酸探针（Nucleic acid prode）是指带有检测标记的已知核苷酸片段，能与互补核苷酸序列退火杂交，并可以被特殊的方法所探知。因此可以用于待测核酸样品中特定基因序列的探测。

核酸分子杂交的基本原理是：具有一定同源性的两条核苷酸单链在一定条件下（适宜的温度及离子强度等），可按碱基互补原则退火形成双链，此杂交过程是高度特异性的。核酸分子杂交发生于两条DNA单链之间者（ssDNA：ssDNA）称。DNA杂交；发生于RNA链与DNA链单链之间者（RNA：ssDNA）称RNA：DNA杂交。

因此，如果把一段已知基因（DNA或RNA）的核苷酸序列用合适的标记物（放射性同位素、荧光色素、生物素和地高辛等）标记，当作探针与变性后的单链基因组DNA进行杂交反应，并用合适的方法（如放射自显影技术或免疫组织化学技术）把标记物检测出来，如果两者的碱基完全配对，它们即结合双链，从而表明被测基因组DNA中含有已知的基因序列（同源序列或片段）；检测不出结合则不含已知序列。

该项技术不仅具有特异性、灵敏度高的优点，而且兼备组织化学染色的可见性和定位性，从而能够特异性地显示细胞的DNA或RNA，从分子水平去研究特定生物有机体之间是否存在着亲缘关系，并可揭示核酸片段中某一特定基因的位置。目前这项技术，已被广泛应用于分子生物学领域。

近年来，随着食品微生物检测技术的发展，核酸探针技术已被越来越多地用于食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌等食源性病原菌的快速检测。

根据核酸分子探针的来源及其性质可分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针及人工合成的寡核苷酸探针等。

一、基因组DNA探针

这类探针多采用分子克隆从基因文库筛选或用PCR技术扩增制备。由于真核生物基因组中存在高度重复序列，制备探针应尽可能选用基因的编码序列（外显子），避免选用内含子及其他非编码序列，否则将引起非特异性杂交而出现假阳性结果。

二、cDNA探针

cDNA探针是以RNA为模板，在反转录酶的作用下合成的互补DNA，因此它不含有内含子及其他非编码序列，是一种较理想的核酸探针。cDNA探针包括双链cDNA探针和单链DNA探针。

双链cDNA探针的制备方法是首先从细胞内分离出mRNA，然后通过逆转录合成cDNA，再通过DNA聚合酶合成双链cDNA分子。将双链cDNA分子插入载体中克隆、筛选、扩增、纯化，然后进行标记即可。

单链DNA探针的制备相对来说要简单些，即将cDNA导人M13衍生载体中，产生大量单链jDNA，标记后即成。用单链DNA探针杂交，可克服双链cDNA探针在杂交反应中的两条链之间复性的缺点，使探针与靶mRNA结合的浓度提高，从而提高杂交反应的敏感性。

三、RNA探针

mRNA作为核酸分子杂交的探针是较为理想的，其优点是：①RNA／RNA和RNA／DNA杂交体的稳定性较DNA／DNA杂交体的稳定性高，因此杂交反应可以在更为严格的条件下进行（杂交温度可提高10℃左右），杂交的特异性更高；②单链RNA分子由于不存在互补双链的竞争陛结合，其与待测核酸序列杂交的效率较高；③RNA中不存在高度重复序列，因此非特异性杂交也较少；④杂交后可用RNase将未杂交的探针分子消化掉，从而使本底降低。

但是，大多数mRNA中存在多聚腺苷酸尾，有时会影响其杂交的特异性，此缺点可以通过在杂交液中加入Poly（A），将待测核酸序列中可能存在的Poly（dT）或Poly（u）封闭而加以克服。另外，RNA极易被环境中大量存在的核酸酶所降解，因此不易操作也是限制其广泛应用的重要原因之一。事实上，极少使用真正的mRNA作为探针，因为其来源极不方便，一般是通过cDNA克隆，甚至基因克隆经体外转录而得到mRNA样或anti-mRNA样探针。

制备的RNA探针方法是，首先把目的基因cDNA片段插入到含有特异的RNA聚合酶启动子序列的质粒中，再将重组质粒扩增、纯化，用限制酶将质粒模板切割，使之线性化，然后在RNA酶的作用下，从启动子部位开始，以cDNA为模板进行体外转录。在体外转录反应体系中，只要提供有标记的核苷酸原料，经过体外转录后就能获得标记的RNA探针。

四、寡核苷酸探针

采用人工合成的寡聚核苷酸片段作为分子杂交的探针，其优点是可根据需要随心所欲地合成相应的序列，避免了天然核酸探针中存在的高度重复序列所带来的不利影响；由于大多数寡核苷酸探针长度只有15～30bp，其中即使有一个碱基不配对也会显著影响其熔解温度（t_m），因此它特别适合于基因点突变分析；此外，由于序列的复杂性降低，因此杂交所需时间也较短。

需要注意的是，短寡核苷酸探针所带的标记物较少，特别是非放射性标记时，其灵敏度较低，因此当用于单拷贝基因的Southern印迹杂交时，采用较长的探针为好。

寡核苷酸探针是以核苷酸为原料，通过DNA合成仪合成的。合成寡核苷酸探针的长度一般为10～50个核苷酸。如果靶DNA或mRNA的序列是已知的，合成寡核苷酸的序列就很容易确定。如果仅仅知道氨基酸的序列，由于遗传密码的兼并性，一个氨基酸兼有几个密码子编码，如以氨基酸顺序推测核苷酸顺序，则可能与天然基因不完全一致，因此探针的设计就复杂得多。

在确定寡核苷酸序列时，一定要使该探针与靶基因序列特异性结合，而与无关序列不产生杂交反应。目前有专门的计算机软件帮助设计合成寡核苷酸探针，可用5’末端标记法、3’末端标记法或引物延伸法标记寡核苷酸探针。

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