甜叶菊是原产于南美洲的一种菊科草本植物。自20世纪70年代引进以来，中国成为全球最大的甜叶菊种植产地之一。甜叶菊富含甜菊苷、莱鲍迪甙A等甜菊糖苷，目前作为一种经济作物。主要制成甜味剂，在食品行业中得到广泛应用圈。甜叶菊除含有甜菊糖苷外，还含有丰富的酚酸、黄酮等多种具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、降血糖和降血脂等作用的活性物质刚。在甜菊糖苷生产过程中会产生大量甜叶菊废渣。这些废渣主要处理方式是焚烧和堆肥，其中的酚酸、黄酮等生物活性成分没有得到高效、合理地利用，反而对环境产生污染染。

Zhao等同通过研究甜叶菊废渣提取物发现。甜叶菊废渣提取物含有绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸A(3，5-二咖啡酰奎宁酸)、异绿原酸B(3，4-二咖啡酰奎宁酸)、异绿原酸C(4，5-二咖啡酰奎宁酸)、槲皮苷、槲皮素等生物活性成分，具有较强的自由基清除能力，并有明显的抗炎作用。其中，异绿原酸A和异绿原酸C是甜叶菊废渣提取物的主要成分。付晓等同使用HPLC法分析甜叶菊绿原酸类成分，其中主要为异绿原酸A、异绿原酸C以及相对低含量的绿原酸。异绿原酸是绿原酸的二咖啡酰基取代异构体，在植物中广泛存在，主要存在忍冬科忍冬属、菊科蒿属植物中，其中包括金银花、杜仲。绿原酸类化合物具有抗氧化、抑菌、抗病毒、抗炎等生物活性。本课题组在近年的研究中证实甜叶菊废渣提取物具有较强的抗氧化、抗炎作用，然而尚未确定其中发挥主要功能活性的物质。异绿原酸作为甜叶菊废渣提取物的主要成分，是否是其主要的抗炎活性物质有待进一步研究。异绿原酸A与异绿原酸C分子式相同。化学结构不同，两者在功能活性上可能存在差异。目前对于甜叶菊废渣提取物及其主要成分异绿原酸A和异绿原酸C的抗炎作用还鲜见报道。随着研究方法和科学技术的不断进步，对甜叶菊的研究开发和综合利用将不断深入。

为研究甜叶菊废渣提取物及其主要成分异绿原酸的抗炎作用，本文通过建立RAW264.7细胞炎症模型，初步评价甜叶菊废渣提取物及其主要成分异绿原酸的体外抗炎作用。通过建立角叉菜胶致小鼠足肿胀急性炎症模型，通过测定小鼠足趾的肿胀程度，以及小鼠血清和肝脏中NO、SOD、MDA和PGE2水平，验证甜叶菊废渣提取物及其主要成分异绿原酸的体内抗炎效果，为开发甜叶菊废渣的经济价值提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

甜叶菊废渣提取物(主要成分：绿原酸4.65％。隐绿原酸2.78％，咖啡酸9.72％，异绿原酸A4.14％，异绿原酸B3.28％，异绿原酸C12.67％，槲皮苷1.88％，槲皮素0.71％)、甜叶菊异绿原酸A和异绿原酸C(＞90％)，河北晨光生物科技集团股份有限公司：地塞米松，MYM生物技术有限公司；N0、S0D、MDA试剂盒，南京建成生物工程有限公司；BCA蛋白浓度试剂盒、角叉菜胶、脂多糖(LPS)、DMEM高糖无酚红培养基，北京索莱宝科技有限公司；PGE2试剂盒，北京方程生物科技有限公司；阿司匹林，沈阳奥吉那药业有限公司；RAW264.7细胞(ATCCNo.TIB-71)，国家实验细胞资源共享平台；噻唑蓝(MTT)，美国Sigma试剂公司；其它试剂均为国产分析纯级。

1.1.2 仪器与设备

SpectmMaxl3连续波长多功能酶标仪，美国MolecularDevices公司；601-06游标卡尺，哈尔滨量具刃具集团有限公司：TGl78型微量离心机，德国HERMLE公司；Axiovert200型倒置显微镜，德国Zeiss公司：TGL-10C型高速台式离心机，上海智城分析仪器制造有限公司：HH-4型数显恒温水浴锅，金坛市科兴仪器厂；GalaxvS型C0₂培养箱，英国RSBiotech公司。

1.1.3 实验动物

SPF级ICR雄性小鼠(6～8周龄)，许可证号为SCXK(京)2012-0001，北京维通利华实验动物技术有限公司。试验期问，动物饲养在温度为(21±2)℃，相对湿度(40±5)％，昼夜明暗交替时问12h/12h环境。动物自由采食和饮水。

1.2 试验方法

1.2.1 甜叶菊废渣提取物及其主要成分异绿原酸

对RAW264.7细胞存活率和N0生成量的影响接种细胞密度为5×10⁴个/mL的细胞悬浮液于96孔平板中，将平板放入37℃，5％C0₂饱和湿度培养箱中培养24h，吸弃上清，加入混合有样品的DMEM完全培养液，使样品的终质量浓度为0.1，0.2，0.5，l，2mg/mL。阳性对照组每孔加入LPS(20μg/mL)。试验孔被分为LPS与异绿原酸A、异绿原酸C、甜叶菊废渣提取物共同作用组和异绿原酸A、异绿原酸C、甜叶菊废渣提取物单独添加组2种，于37℃、5％C0₂饱和湿度培养箱内培养24h后收集上清液，选用N0试剂盒测定N0生成量。选用MTT试剂盒测定各组细胞存活率。

1.2.2 动物分组给药

药ICR雄性小鼠(6～8周龄)110只，适应环境饲养1周，正常喂食喂水，适应期后随机分为对照组、地塞米松组(10mg/kgbw)、阿斯匹林组(10mg/kgbw)、甜叶菊废渣提取物、异绿原酸A和异绿原酸C组，其中样品组分为低剂量(0.5mg/kgbw)、中剂量组(1.0g/kgw)、高剂量组(2.0kg/kgbw)。连续给药7d，每日灌喂药品1次，每3d称量小鼠体重，并根据小鼠体重变化情况调节给药剂量。

1.2.3 角叉菜胶致小鼠足趾肿胀的测定

按照1.2.2节对小鼠分组给药，末次给药30min后，给每只小鼠左侧足趾皮下注射25μL1％角叉菜胶，右侧足趾不作处理。4h后分别用游标卡尺准确测量每只小鼠2只足趾的厚度，以左、右后肢足趾厚度之差表示炎症肿胀度。计算各组肿胀度值及肿胀抑制率。

1.2.4 小鼠血清中N0、S0D、MDA和PGE2的测定

成足趾肿胀度测量后，摘取所有小鼠的眼球，取其血液于2mL离心管中。置37℃水浴中促其凝固。然后4℃，3000r/min离心10min，得到上清液即血清。依照试剂盒说明书测定小鼠血清中S0D、MDA、N0和PGE2含量，于24h内完成全部测定，保证数据的可靠性。

1.2.5 小鼠肝脏中N0、S0D、MDA和PGE2的测定

将处死的小鼠解剖，取肝脏用4℃预冷的生理盐水洗去血液，滤纸拭干后置于离心管内，放入液氮速冻，待全部解剖完成后转移至-80℃冰箱保藏，备用。取相同部位肝脏0.1mg于匀浆管中，加入0.9mL预冷的生理盐水。用组织捣碎机10000r/min上、下研磨，每次10s，间隔30s，连续5次，制成10％肝匀浆。将制备好的匀浆液在4℃，3500r/min条件下离心15min，吸取上清液，于-80℃保存备用。依照试剂盒说明书测定小鼠肝脏匀浆中蛋白、S0D、MDA、N0和PGE2含量，于24h内完成全部测定，保证数据的可靠性。

1.2.6 数据处理与分析

试验结果以平均值±标准偏差表示，采用SPSS19.0进行单因素方差分析(0ne-wavANOVA)，多重比较采用Duncan法，P＜0.05为显著差异，P＜0.01为极显著性差异。

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